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Nannochloropsis granulata BDH02 (KC128500)와 Chlorella vulgaris (KMMCC-120)종은 영남대학교와 한국해양미세조류은행(Korea Marine Microalgae Culture Center, KMMCC)에서 각각 구입 하였다. 배양배지는 Erd-Schreiber’s medium (ESM) 사용하였으며 배지의 조성은 다음과 같다; NaNO₃ 12 mg, K₂HPO₄ 0.5 mg, vitamin B₁₂ 0.1 μg, biotin 0.1 μg, thiamine HCl 10 μg, Fe-EDTA 25.9 μg, Mn-EDTA 33.2 μg, tris (hydroxymethyl)aminomethane 100mg(Provasoli et al.[1957]). 배지의 pH는 8.0으로 조절하였으며 해수는 10, 30, 50 psu로 염분을 조절하기 위해 질소와 인 성분이 제거된 해염(Red Sea, Israel)를 사용 하였다. 염분은 SK-10S digital salt densimeter (SATO, JPN) 장비를 활용하여 정확하게 측정하여 실험을 진행하였다. 염분을 맞춘 각각의 배지는 15, 30, 45 °C로 조절된 multi-plant growth chamber (JEIO TECH, Korea)에서 배양하였으며 광주기는 12:12의 L/D cycle로, 광도는 150 μmol m^-2 s^-1으로 유지 하였고 2 L min^-1의 flow rate로 aeration을 조절하여 배양기간 동안 유지시켜주었다. 초기 세포 농도는 5×10⁵ cells mL^-1 였으며, 배양용기는 2 L의 Erlenmeyer flask (IWAZAKI, JPN)를 사용하였고 총 용량을 1 L로 맞추어 배양을 진행하였다.

성장은 흡광도 기법을 이용하여 측정하였으며 매 24시간 마다 synergy microplate reader (BioTek, USA)를 활용하여 96-well plate에서 600 nm 파장으로 optical density (OD)를 측정하였고 Axio Vert.A1 광학 현미경(ZEISS, GER) 및 혈구계수기를 사용하여 셀 농도를 측정, 검량선을 만들고 배양된 미세조류의 OD 값을 적용하여 세포수를 계산하였다(Al Ahmad et al.[2014]). Specific growth rate (SGR), divisions per day (DD), generation time (GT)은 다음의 계산식을 이용하여 구하였다(Fogg and Thake et al.[1987]; Levasseur et al. [1993]).

N_i, N_t: 대수성장기에서 초기와 t일 후의 세포농도 (Cells mL^-1)
t_i, t_t: 대수성장기에서 초기와 t일

미세조류의 바이오 매스는 Zhu and Lee (1997)의 방법을 이용하여 다음과 같이 측정하였다(Zhu and Lee [1997]). 먼저 10 mL 미세조류 배양액을 미리 건조하여 무게를 잰 0.2 μm pore-size의 glass fiber filters (Whatman GF/F, 47 mm)로 여과한 이후, 증류수로 헹궈준 뒤 필터를 80 °C의 drying oven에 건조한 뒤, dessicator를 이용하여 방냉 하였다. 이후, 건조된 필터에 함유된 바이오 매스를 전자저울로 정확하게 무게를 측정하였다.

광합성 색소인 chlorophyll a (C_a), chlorophyll b (C_b), total carotenoids는 Wellburn (1994)이 제안한 메탄올 추출 방법을 이용하여 다음과 같이 측정하였다(Wellburn[1994]). 먼저, 미세조류 배양액 5 mL를 3분간 13,000 × g 에서 원심 분리하여 상등액을 제거한 후, 증류수를 이용하여 세포를 3회 씻어주었다. 그 후 다시 원심분리 후 상층액을 제거한 뒤 1 mL의 메탄올을 첨가하여 60 °C로 조절된 heating block에서 30분간 추출한 후 10,000×g에서 3분간 원심 분리한 후 상등액을 7315 spectrophotometer (Jenway, Staffordshire, UK)를 이용하여 470 nm, 653 nm, 666 nm에서 각각 측정한 후 다음의 계산식을 이용하여 구하였다(Wellburn[1994]).

A₆₆₆: 666 nm에서의 흡광도(Relative value)
A₆₅₃: 653 nm에서의 흡광도(Relative value)
A₄₇₀: 470 nm에서의 흡광도(Relative value)
C_a: chlorophyll a의 양(ppm)
C_b: chlorophyll b의 양(ppm)

중성지질의 함량은 Chen이 제안한 dimethyl sulfoxide (DMSO)와 microwave를 활용한 Nile red 분석법을 사용하여 다음과 같이 측정하였다(Chen et al.[2009]). 미세조류의 상층액 50 μL를 DMSO 100 μL와 혼합한 후 Nile red 용액(100 mg L^-1 in acetone; Sigma-Aldrich)을 10 μL 첨가하고 Q500 sonicator (QSONICA, UK)를 이용하여 1분간 sonication을 하였다. 그 후 Synergy microplate reader (BioTek, USA)를 이용하여 excitation 520 nm 그리고 emission 580nm 파장으로 형광값을 측정하였다. 표준 검량선은 triolein (Sigma-Aldrich Co., USA)을 사용하였다.

미세조류 녹말의 함량은 McCready et al.(1950)과 Brányiková et al.(2011)의 방법을 이용하여 다음과 같이 측정하였다(McCready et al.[1950]; Brányiková et al.[2011]). 미세조류를 동결 건조한 후 건조된 바이오 매스 10 mg을 3차 증류수 10 mL와 섞은 후 강하게 vortex하여 균질 하게 섞은 뒤 1 mL를 분취하여 3분 동안 10,000×g로 원심분리 하였다. 이후 상층액을 제거한 뒤 3차 증류수 0.25 mL를 첨가한 뒤 heating block에서 15분 동안 100 °C로 맞추고 hydrolysis 반응을 일으켰다. 그 후 상온에서 1시간 동안 식히고, 30% perchloric acid 0.25mL를 첨가한 후 25 °C에서 15분간 shaking 해주었다. 그 후 증류수 0.6 mL와 혼합물을 섞고 3분간 10,000×g로 원심 분리한 뒤 8분간 100 °C에서 보관한 후, 혼합물 0.4 mL에 anthrone 용액(0.2 g anthrone reagent in 100 mL of 72% H₂SO₄) 2 mL를 첨가하였다. 그 후 상온에서 식힌 뒤에 Synergy microplate reader (BioTek, USA)를 이용하여 625 nm에서 흡광도를 측정하였고 포도당(glucose)을 표준 물질로 검량하여 녹말의 농도를 구하였다.

실험은 3반복으로 진행하였고, two-way ANOVA와 one-way ANOVA 및 post-hoc t-test를 Microsoft Excel 2007 프로그램 (Microsoft, USA)을 활용하여 통계학적 분석을 하였으며, P<0.05이하의 값을 나타내는 통계치를 구하였다.

이번 연구는 Chlorella vulgaris와 Nannochloropsis granulata를 바이오 연료 사업에 적용할 시 염분이 약 30-35 psu인 자연 해수를 기준으로 10-50 psu의 염분 구간을 설정하여 실험을 진행하였고, 온도는 일반적인 미세조류의 배양 최적 조건인 25 °C를 기준으로 구간을 설정하였다.

Specific growth rate (SGR), division per day (DD), generation time (GT)의 값은 미세조류 회분배양 10일 후에 측정하였으며 N. granulata와 C. vulgaris는 서로 비슷한 성장률 수치를 보였지만, 서로 다른 염분과 온도 조건 하에서는 Table 1 및 Fig. 2에서 보는 바와 같이 두 종이 서로 다른 양상을 나타냈다. C. vulgaris와 N. granulata의 최대 SGR은 30 °C, 30 psu 배양에서 나타났고 최소값의 SGR를 보인 20 °C, 50 psu 배양 보다 C. vulgaris의 경우 1.29배, N. granulata의 경우 1.33배 정도의 높은 수치를 나타냈다(Table 1). 또한, Table 1에서 C. vulgaris 와 N. granulata의 성장은 증가된 DD 및 감소된 GT와 함께 온도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 측정된 바이오 매스의 값을 통해 같은 결과 값을 얻을 수 있었다. 기존 연구에 의하면 온도는 미세조류의 성장률, 세포의 크기에 영향을 줄 수 있으며 종에 따라 그 영향이 다르다고 보고되어 왔으며, 그 이유는 배양 온도가 미세조류의 탄소와 질소 흡수 및 활용에 큰 영향을 줄 수 있기 때문이라 알려져 있다(Juneja et al.[2013]; Raven and Geider[1988]). 또 다른 연구에 따르면 온도가 낮아질 경우 대사활성에 따른 광 저해가 발생하며 광합성에 연관된 PsbA의 합성이 저해되기 때문에 미세조류의 성장은 온도에 의해 큰 영향을 받을 수 있다고 알려져 있다(Juneja et al.[2013]). 이번 연구에서 우리는 서로 다른 염분 조건에서 미세조류 성장이 온도에 의해 영향을 받을 수 있다는 사실을 확인 하였는데 C. vulgaris와 N. granulata의 배양실험에서 세포 성장과 바이오 매스를 각각의 온도에서 비교했을 경우 10 psu보다 30 psu와 50 psu에서 증가하는 경향성을 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었다. 또한 10 psu를 기준으로 비교하면 50 psu에서 C. vulgaris와 N. granulata의 하루당 세포 분열이 25 °C에서 10일 배양 동안 C. vulgaris에서는 1.08배, N. granulata에서는 1.12배 더 증가했다는 사실을 확인할 수 있었다(Fig. 1, Table 1). 이전 연구에서 보고된 내용에 따르면, 세포의 내부와 외부 사이의 염분농도를 조절하기 위한 삼투압 조절로 인해 낮거나 높은 염분에 노출된 조류는 성장률에 큰 영향을 받을 수 있다고 보고된 바 있다(Juneja et al.[2013]; Priya[2013]). 또한 삼투압에 의한 스트레스는 세포막 수분 이동에 영향을 미치며 그와 더불어 영양 염류 흡수에도 큰 영향을 준다는 보고가 있다(Ding et al.[2013]). 따라서 위와 같은 이유로 인해 미세조류 성장 억제는 낮은 염분(10 psu)과 비교할 때 높은 염분(50 psu)에서 삼투압에 의한 영양염 공급 시스템의 이상으로 인해 성장이 상대적으로 감소했다고 보여진다. 또 다른 연구 결과에 따르면, 높은 염분은 조류 세포에 활성산소종에 의한 산화 스트레스를 공급하는 원인이 되며 산화 스트레스에 따른 손상과 관련된 활성 산소종(ROS)으로 부터 세포막의 극 지질을 보호하기 위한 항산화 효소 발생에 따라 세포 신호 또한 영향을 받을 수 있다고 알려져 있다(Kumar et al.[2010]). 결론적으로 우리는 항산화 효소 분비의 최적화된 온도가 존재하기 때문에 미세조류 산화적 손상을 방지할 수 있으며 그러한 작용이 미세조류의 성장에 큰 영향을 주었을 것이라 추측한다.

Fig. 1. 
Effect of different salinities (10 psu: ○, 30 psu: ▲, 50 psu: □) and temperatures (A, a: 20 °C, B, b: 25 °C, C, c: 30 °C) on the growth of Chlorella vulgaris (capital letters) and Nannochloropsis granuilata (lowercase letters) under 12:12 of L/D cycle and 150 μmole m^-2 s^-1 of light intensity.

Fig. 2. 
Simultaneous effect of salinities (10, 30, and 50 psu) and temperatures (20, 25, and 30 °C) on the biomass (g L^-1) production of Chlorella vulgaris (A) and Nannochloropsis granulata (B). Different letters exhibited significant differences (p<0.05). Both capital letters and lower case letter exhibited comparison of different temperatures and salinities respectively.

미세조류의 광합성 색소는 용매의 종류와 사용되는 cuvett cell의 투과 길이(path length)에 따라 그 측정식이 다르게 나타나며 이미 여러 측정식들이 보고된 바 있다(Lorenzen[1967]; Wellburn[1994]; Tkachuk et al.[1988]). 이번 연구에서는 methanol 추출물을 활용하여 광합성 색소를 분석하였으며 기존에 methanol, acetone, ethanol, chloroform, dimethylformamide 및 dimethyl sulfoxide 등 다양한 유기 용매 분석 방법에 대한 측정식을 서술한 Wellburn (1994)의 방법을 사용하여 광합성 색소를 분석하였다.

우리는 다양한 염분 및 온도 조건에서 10일간 배양한 미세조류의 chlorophyll a와 total carotenoid 함량을 측정하였으며, Table 2에서 보는 바와 같이 C. vulgaris의 경우 광합성 색소인 chlorophyll a 양은 50 psu를 제외하고 온도 의존적으로 증가하였고 염분에 의해 의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 그러나, N. granulata 에서는 색소의 양이 온도 의존적으로 50 psu의 조건에서 증가한다는 사실을 확인할 수 있었으며, chlorophyll a는 염분에 의존적으로 감소하였음을 확인할 수 있었다. 또한 색소양은 20 °C, 25 °C 조건에서 염분 의존적으로 감소하였으며 30 °C에서는 또 다른 경향이 관찰되었다. Chlorophyll a는 미세조류의 광합성 주요 인자이기 때문에 chlorophyll 양의 높은 축적과 낮은 축적 정도의 차이는 조류의 성장과 본질적으로 관련이 있다. 이번 연구에서 우리는 낮은 온도(20 °C)에서는 염도가 높아짐에 따라 chlorophyll 양이 감소했다는 사실을 관찰하였으며 높은 온도에서는 서로 다른 경향성을 보인다는 사실을 확인하였다. 광합성과 연관된 낮은 온도와 높은 염분은 chlorophyll 양을 감소시키며 기존 연구에서는 온도와 염분은 광합성 활동에 영향을 미친다는 보고가 있었다(Ding et al.[2013]). 높은 염분은 광합성 저하의 원인이 될 수 있으며 낮은 온도 또한 전자 전달과 이산화탄소 고정 감소로 나타나는 광계 II 활동의 감소 원인 될 수 있다(Juneja et al.[2013]). 따라서 이번 실험의 결과로부터 조류 성장이 제한 받는 조건에서 chlorophyll a가 증가된 이유는 미세조류가 성장이 힘든 환경에서 광합성효율을 극대화시켜 생존하기 위한 대사활동의 과정이라 생각된다. 또한, 우리는 30 °C에서 chlorophyll의 경향성이 다르게 보인 이유는 생화학 합성에 연관된 효소의 최적온도에 따른 대사 경로 변화로 인한 것으로 판단하였다. 그리고 높은 염분에서는 ROS에 의해 기인한 산화스트레스에 의해 엽록체를 구성하는 막구조가 변형되어 광합성 색소 축적을 저해시킨 것으로 예측되며 그 결과 chlorophyll a 합성이 억제되고 바이오 매스 생산에 영향을 미친 것으로 판단된다. 높은 염분과 온도에서 성장과 광합성 색소 억제에 관련한 결과는 이미 다양한 종에서 보고된 바 있다(Vonshak et al.[1996]; Kirrolia et al.[2012]; Ding et al.[2013]). 다음으로 Table 2에서 보는 것과 같이 우리는 total carotenoid 축적 또한 온도와 염분에 의해 상당한 영향을 받았음을 확인할 수 있었으며 C. vulgaris와 N. granulata 두 종 모두에서 total carotenoid의 양은 온도 의존적으로 증가 하였고 C. vulgaris의 경우 모든 온도에서 염분 의존적으로 증가하였으며, N. granulata의 경우 모든 온도 조건의 30 psu에서 높은 carotenoid 수치가 관찰 되었다. Carotenoid는 강한 항산화 효과를 나타내며 외부 환경의 손상으로부터 엽록소 체계를 방어하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 스트레스로부터 엽록체를 보호할 뿐만 아니라 에너지 전달 과정도 수행한다(Armstrong and Hearst[1996]; Juneja et al.[2013]). Total carotenoid는 광손상 발생시 높아지며 이를 유발하는 높은 온도에서 증가 된다는 사실이 이미 보고 되어있다(Juneja et al.[2013]; Liu and Lee[2000]). 기존 연구와 비슷하게, 이번 연구에서도 온도 의존적으로 미세조류의 total carotenoid가 증가 되었다는 사실을 확인할 수 있었고 그 이유는 외부 스트레스에 대한 보호 기작 때문이라 생각된다. 또 다른 연구에 의하면 높은 염분은 Dunaliella sp.에서 carotenoid 축적을 높여주는 원인이 될 수 있다고 밝힌바 있다(Borowitzka et al.[1990]). 그러나 이번 연구에서 N. granulata의 경우 기존에 연구된 내용과 비슷한 경향을 나타내지 않았다(Table 2). 그러므로 carotenoid 축적은 종에 따라 그 축적 변화가 다르다고 판단된다.

중성지질의 분석은 10일간 배양 후에 Nile red를 활용한 형광법으로 측정 되었다. 이전 보고에 따르면, 단단한 엽록체 막과 함께 두껍고 단단한 세포벽을 갖고 있는 Chlorella와 같은 녹조류의 중성지질의 측정은 dimethyl sulfoxide (DMSO)와 microwave 또는 sonication을 사용한 방법이 효율적이라는 보고가 있다(Chen et al.[2009]; Ren et al.[2013]). Fig. 3에서 보는바와 같이 각 미세조류의 중성지질은 각각의 다른 염분과 온도로 이루어진 조건 하에 종마다 다른 경향을 보인다는 사실을 확인하였다. C. vulgaris의 경우 중성지질이 25 °C, 30 °C에서 염분 의존적으로 증가 하였고, 20 °C에서는 50 psu일 때 감소 하였다. 이와 비슷하게, N. granulata 배양에서 중성지질의 양은 20 °C, 50 psu에서 감소되었고 25 °C와 30 °C에서 증가하였다. 기존의 여러 연구에서 이미 미세조류의 중성지질의 축적량은 염분에 의해 증가 될 수 있다는 보고가 있었다(Zhila et al.[2011]; Fabregas et al.[1984]). 또한 염분에 의한 스트레스는 미세조류의 중성지질 축적을 향상 시킬 수 있다는 보고도 있었다(Yilancioglu et al.[2014]; Kumar et al.[2010]). 하지만 이번 연구에서는 다른 온도 조건하에서 염분이 중성지질 축적에 서로 다른 영향을 준다는 사실을 확인할 수 있었다. 아직 더 많은 연구가 필요하지만, 낮은 온도에서의 당 대사를 일으키는 효소 불활성으로 인해 중성지질 축적량의 변화를 주었다고 생각된다. 또한 Fig. 3에서 보는 바와 같이 염분에 의한 중성지질 축적은 온도에 따라 전혀 다른 경향성을 나타내었으며 특히 10 psu, 30 psu에서 온도 의존적으로 중성지질이 감소 되었다는 사실을 확인할 수 있었고 50 psu에서는 오히려 높아지는 전혀 다른 경향을 보인다는 사실을 확인하였다. 그리고 중성지질은 C. vulgaris의 50 psu 배양에서 온도 의존적으로 증가하였으며 N. granulata 에서는 30 °C에서 감소하는 경향을 보였다. 이러한 두 종의 다른 경향성은 각 종마다 서로 다른 대사 경로로 인한 다양한 비생물적 스트레스에서 생화학적 축적 양상이 다르다는 사실을 보여준다.

Fig. 3. 
Simultaneous effect of salinities (10, 30, and 50 psu) and temperatures (20, 25, and 30 °C) on the neutral lipid content (μg per 10⁶ cells) of Chlorella vulgaris (A) and Nannochloropsis granulata (B). Different letters exhibited significant differences (p<0.05). Both capital letters and lower case letter exhibited comparison of different temperatures and salinities respectively.

미세조류에 축적된 녹말의 양은 기존에 연구된 바 있는 담수 미세조류인 Chlorella sp.의 perchloric acid를 활용한 hydrolysis 방법을 사용하였고, anthrone solution과 sulfuric acid의 반응에 따른 발색 변화에 따라 녹말을 분석하였다(Brányiková et al.[2011]). 녹말은 각각의 온도와 염분 조합에서 10일간 배양 후 측정 하였으며 Fig. 4A에서 보는 바와 같이 C. vulgaris에서는 50 psu를 제외한 10 psu, 30 psu에서 온도 의존적으로 증가하였고 30 °C 온도를 제외하고 또한 염분 의존적으로 증가하는 경향성을 나타냈다. N. granulata는 10 psu에서만 녹말의 양이 온도 의존적으로 약간 증가하였고 30 psu와 50 psu에서 특별한 경향이 관찰 되지는 않았지만 염분 의존적으로 모든 온도에서 증가된다는 사실을 확인할 수 있었다. 이전 연구에서 미세조류의 탄수화물 합성은 Calvin cycle로 알려진 대사 과정을 통해 광 반응시 이미 형성된 adenosine triphosphate (ATP)와 같은 인 결합을 포함한 에너지를 사용함으로써 어두운 상태에서도 인산화대사에 의해 합성 과정이 이루어 질 수 있다는 사실이 밝혀진 바 있다(Emerson et al.[1944]; Juneja et al.[2013]; A. Lehninger and Nelson[2005]). 미세조류의 녹말 축적에서 온도에 의한 영향은 종마다 다른 탄수화물 축적 양상을 보이기 때문에 여전히 정확한 경로가 밝혀지지는 않았다(De Oliveira et al.[1999]; Chen et al.[2013]). 이번 연구에서는 몇몇 미세조류의 녹말 양의 감소를 뚜렷하게 보였고 이러한 결과는 α-amylase와 α-glucan phosphorylase와 같은 효소들이 높은 온도(38 °C)에서 활성화 되었기 때문이라고 판단된다(Nakamura[1983]; Nakamura and Imamura[1983]; Juneja et al.[2013]). 그러므로, 두 종의 미세조류의 녹말 축적 패턴이 다른 이유는 종마다 다른 효소의 활성 정도의 차이에 의해 기인한 것이라 생각된다. 또한 이번 연구에서는 흥미롭게도 높은 온도(30 °C)에서 C. vulgaris 가 50 psu일 때 오히려 녹말이 감소되었다는 사실을 확인할 수 있었으며(Fig. 4A), 기존의 연구에서도 높은 염분은 미세조류 Tetraselmis sp. 종의 녹말 축적을 억제시킨다는 비슷한 보고가 있다(Yao et al.[2013]). 그러나 N. granulata 세포에서 녹말의 양은 염분 의존적으로 오히려 증가 하였다(Fig. 4B). 이러한 사실 또한 종의 대사활성 차이에서 기인한 것으로 판단된다.

Fig. 4. 
Simultaneous effect of salinities (10, 30, and 50 psu) and temperatures (20, 25, and 30 °C) on the starch content (μg per 10⁶ cells) of Chlorella vulgaris (A) and Nannochloropsis granulata (B). Different letters exhibited significant differences (p<0.05). Both capital letters and lower case letter exhibited comparison of different temperatures and salinities respectively.